为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》 ,保护生态环境,保障人体健康,规范水中浮游植物的测定方法,制定本标准。
本标准验证单位,上海市环境监测中心、浙江省海洋监测预报中心、杭州市环境监测中心站、宁波市环境监测中心、江苏省常州环境监测中心和自然资源部第二海洋研究所。
当样品最大过滤体积1000 ml时,方法定量检出限为40 cells/L。
本标准引用了下列文件。凡是不注日期的引用文件,其有效版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验用水或实验方法
在水中营浮游生活的藻类植物,通常浮游植物就是浮游藻类,包括原核的蓝藻门和其它各类线
样品通过一定孔径的滤膜,群体、丝状体及单细胞浮游植物截留在滤膜上,滤膜经透明处理后在显微镜下镜检,对浮游植物进行分类计数。
除非另有说明,分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂,实验用水为新制备的去离子水或蒸馏水。
称取60 g碘化钾,5.1,溶解在1000 ml水中,再加入40 g碘,5.2,,充分搅拌使其溶解,静置24 h以上。当溶液接近饱和时会有沉淀出现,使用前需去除沉淀。鲁哥氏液在室温避光条件下可保存1年。
(1)将一张未使用的滤膜放入盛水的烧杯中,若滤膜被水完全浸透,则滤膜可水化。
(2)另取一张未使用的滤膜,置于滴有显微镜浸没油的载玻片上,若滤膜被浸没油完全浸润,则滤膜可透明。
6 1 正置或倒置显微镜,物镜4×、 10×、 20×、 40×, 目镜10×。
6 4 微孔滤膜过滤器,包括漏斗,直径25 mm,容量200 ml,、多孔聚酯滤膜支撑板、收集瓶。
注,载玻片和盖玻片使用前需用浓盐酸和乙醇浸泡。若条件允许,可选择耐洁载玻片或盖玻片。
6 1 1 25号浮游生物网, 网孔直径为0.064 mm, 网呈圆锥形, 网口套在铜环上, 网底端有出水开关活塞。
6 12 1L,2 L样品瓶、 50ml样品瓶,材质为玻璃、聚丙烯或聚乙烯。
6.14一般实验室常用设备,包括去离子水设备,不一样的规格量筒,移液管,移液枪,烧杯,玻璃搅拌棒等。
浮游植物样品采集点位设置参照HJ/T 91等的相关规定执行。若湖泊、水库水体是圆形或接近圆形的,应从此岸至彼岸至少设两个互相垂直的采样断面,若是狭长的区域,至少应设三个互相平行、间隔均匀的断面。河流水体,在一个采样断面上,水面宽小于50米时,只设中泓1条垂线米时,在左、右岸有明显水流处设2条垂线米时,在左、 中、右设三条垂线。
浮游植物在水体中不仅水平上有差异,而且垂直分布也有不同。正常的情况下, 当湖泊、水库水深不足1米时,可在1/2水深处采样, 当湖泊、水库水深不超过2m时,可在表层下
0.5m处采样,若水体透明度很低,可在底层加采一个样品与表层样品合成混合样,若水体超过2m时、透明度较大,可按表层、透明度的0.5倍、 1倍、 2.5倍和3倍处各取一个样品,将各层样品混合均匀,再从混合样品中取样作为定量样品,也可在有光层内按3m~6m,或更大间距,进行等间距采样。分层层数与监测目的有关,分层越密,获取的信息越详细。正常的情况下,河流可不分层采样,直接在水面下0.5 m处采样,或在下层,河底上0.5m,加采一个样品,两次混合即可。若需了解浮游生物垂直分布状况,不一样的层次分别采样后,不需混合。
有些浮游植物,如蓝藻,常上浮在水面或有成片、成带分布的情况,采样时应加以注意。应尽可能保持在每天的相近时间采样,如上午8点,10点时。
使用25号浮游生物网,6.1,采集定性样品。关闭浮游生物网底端出水开关活塞,在水面表层至0.5 m水深处以20 cm/s,30 cm/s的速度做“∞”形往复缓慢拖动约1~3 min,也可沿表层至0.5m水深出缓慢拖动,滤过1.5 m3,5.0 m3体积的水体。将浮游生物网提出水面,水体自然通过网孔,待底部还剩少许水体(5 ml)10 ml,时,将底端出口伸入采样瓶
采集1 L,2 L水至样品瓶,6.12,中,立刻加入10ml鲁哥氏液,5.4,固定,若浮游植物密度过低,应酌情增加采水量。样品瓶也可提前加好鲁哥氏液,5.4,带至现场。
注意,样品采集完成后,样品瓶中样品液面至瓶盖应留有一定空间,便于样品混匀。
定性样品应避光保存在4℃,10℃环境条件下,保存时间不超过36h。高温环境下采集的定性样品在保存前需逐渐降温,避免气温变化过快对浮游植物细胞产生损伤。
每1000 ml定量样品中加入15 ml鲁哥氏液,5.4,。室温避光条件下可保存3周, 1℃,5℃冷藏避光条件下可保存12个月。
样品在保存过程中,应每周检查鲁哥氏液的氧化程度,如果样品颜色变浅,则应向样品中补加适量的鲁哥氏液,直至样品颜色恢复为黄褐色。
若定量或定性样品含大量有机质、需储存12个月以上时,应加入甲醛溶液,5.3,固定,每100ml样品加4ml甲醛溶液,5.3,。
完成预检装片,8.1.2,8.1.5,,判断样品浮游植物密度,8.2.2,,以便于样品的后续分析。
样品过滤前,将样品瓶水平转动、垂直颠倒至少30s,充分混匀,混匀动作要轻且速度均匀。
样品浮游植物密度在108 cells/L以上时,样品过滤体积0.5 ml(2 ml)样品浮游植物密度在107cells/L数量水平时,样品过滤体积5 ml(10 ml)样品浮游植物密度在106 cells/L数量水平时,样品过滤体积5 ml(25 ml)样品浮游植物密度在105 cells/L数量水平时,样品过滤体积10 ml,50 ml。当样品过滤体积小于5 ml时,用实验用水将样品再悬浮,最后在悬浮样品中加几滴鲁哥氏固定液,5.4,。
注1, 当样品过滤体积大于漏斗容量时,需保证后续样品加入不扰动滤膜上的浮游植物。
用量筒、定量移液器或移液枪,6.14,定量量取样品体积,将样品加入微孔滤膜过滤器,6.4,漏斗中,静止2 min(3 min)使用线,抽滤,控制线 in Hg),抽滤至漏斗中有0.5 cm液层时关掉真空泵,使剩余液体完全通过漏斗。切忌抽干滤膜,抽滤过程一次完成,不建议后续加入样品, 以免影响滤膜上浮游植物的分布。
注, 当样品过滤体积大于漏斗容量时,需保证后续样品加入不扰动滤膜上的浮游植物。
样品过滤完成后,用无齿扁咀镊子,6.10,取下滤膜,保持有藻面朝上,放在滴有2滴显微镜浸没油,5.5,的载玻片,6.6,上,再用透明玻璃滴棒,5.5,在滤膜上滴2滴显微镜浸没油,5.5,,将载玻片,6.6,放入凉片板,6.9,,置于烘箱,6.3,中, 70℃±2℃加热2h。 2h后取出凉片板,6.9,,观察滤膜是否透明。若已透明,再在滤膜上滴2滴显微镜浸没油,5.5,,盖上盖玻片,6.5,,装片制备完毕。若滤膜加热2 h后未透明,可延长加热时
计数前标定显微镜,6.1,,确定计数视野面积,Whipple视野或目镜视场视野,。显微镜标定设备包括Whipple目镜分化板,6.7,和1 mm镜台测微尺,6.8,。Whipple 目镜分划板标定详见资料性附录B。
装片,8.1.5,置于显微镜,6.1,载物台上,用whipple视野法或目镜视场视野法进行镜检计数,记录每个视野的浮游植物种类及数量。根据藻细胞大小,选择200x、 400x放大倍数对藻类进行分类计数。whipple视野法计数规则,视野中处于下边界及右边界线的藻类计入总数(Y),处于上边界及左边界线的藻类不计入总数(N),从里到外,计数每一个接触计数边界的藻类,忽略每一个接触非计数边界的藻类,详见图1。若出现丝状体等较大个体显著穿过两个或多个格子的边界时,需在低倍镜下单独计数,再计入总数。丝状体或似球形群体细胞数估算详见资料性附录C。计数时,缓慢移动显微镜载物台,确保滤膜上、下、左、右和中部区域的视野均有抽样。显微镜视野在滤膜上的移动示例详见图2,需避免在一个区域重复抽样。
较低密度样品计数时,建议选择目镜视场视野法。不同样品推荐视野类别及计数视野数详见表1。
A t——滤膜有效面积,有效过滤面积,(mm2)Ac——计数面积,镜检计数的视野面积之和,(mm2)
1 1 1 最小计数量。正常的情况下,浮游植物种类的计数误差可设定±20%,优势种种类计数最少100,150个。要达到10%的计数误差,需增加4倍的计数量。计数误差应指明是针对浮游植物总分类单元,还是针对某一种类。
1 1 2 每批次样品中,随机抽取10%的样品做平行双样测定,计算计数差异百分比(PDE),浮游植物总密度的PDE因项目要求而定。 PDE按式(2)计算,公式(2)中Lab 1和Lab2分别代表平行双样的检测结果。
1 1 4 每批次滤膜作延展性测试,要求滤膜透明处理前后直径变化在1.0 mm以内。
1 1 5 从事浮游植物鉴定的技术人员需定期参加专业方面技术培训。定期开展人员或实验室间比对, 比对数据结果分析参照11.2。
附录A给出了滤膜法检出限计算方式。滤膜法检出限与计数视野数、可计数视野总数及子样本体积有关。假设样品在滤膜上符合随机分布,可通过泊松统计来确定其定量检测限MDL。MDL计算公式见下式。
MDL—置信水平α的方法检出限,单位,个/升或细胞数/升,α—置信水平,一般选择置信水平0.01或0.05,ncounted—参与计数的视野数,个,n to ta l—可用于观察的计数视野总数,个,
标定目镜分划板, 以计算不同放大倍数下的计数视野面积。whipple grid是一种网格型目镜分划板,外观为刻有方格的玻璃圆盘,包含一个大格,大格被均分成100中格,其中心位置处格子又被均分成25个小格。Whipple grid分划板详见图B.1。使用台测微尺标定Whipple gird分划板。镜台测微尺规格为1 mm,均分成100等分,每分格代表10μm,台测微尺详见图B.2。
B.2.2将台测微尺放在显微镜载物台上,刻度朝上。先低倍对焦,使视野中台测微尺刻度清晰,